引發(fā)人ELISA試劑盒測定結(jié)果錯誤的因素分析
點擊次數(shù)：1275 更新時間：2015-08-04
人ELISA試劑盒是通過化學(xué)反應(yīng)的測定終產(chǎn)物顏色的方法進行了IgG的定量測定，廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域研究，并且具有靈敏度高，操作簡單等優(yōu)點，但在實際操作中，影響實驗結(jié)果的因素較多，在嚴(yán)格按照說明操作的前提下，除了正常反應(yīng)外，有時?？梢姷揭恍╁e誤結(jié)果(即假陽性或假陰性結(jié)果)。主要引發(fā)ELISA測定錯誤結(jié)果的原因有以下三個：標(biāo)本因素，試劑因素以及操作因素。人ELISA試劑盒血清是zui常用的ELISA標(biāo)本，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：
1、外源性物質(zhì)：外源性物質(zhì)通常是由于用于ELISA測定的血標(biāo)本的采集、貯存不當(dāng)?shù)仍蛩隆?/span>
1）標(biāo)本保存不當(dāng)
在冰箱中保存過久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深、甚至造成假陽性;標(biāo)本放置時間過長(如一天以上)，有時抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集;如不能立即測定，5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存;凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測定，但混勻時應(yīng)輕柔，不可強烈振蕩。
2）標(biāo)本受細菌污染
因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。
3）標(biāo)本溶血
由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測定中，會導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時必須注意避免溶血。
4）標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響
人ELISA試劑盒抗凝劑(如肝素，EDTA)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性)及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定干擾作用。
2、內(nèi)源性物質(zhì)：常見的內(nèi)源性物質(zhì)主要有類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。
1）嗜異性抗體
人類血清中含有能與嚙齒類動物(如鼠等)Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig (s) ，但加入量不足或亞類不同時無效。
2）嗜靶抗原的自身抗體
抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結(jié)果。為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測定前需用理化方法將其解離后再測定。
3）類風(fēng)濕因子
人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性。解決該情況的辦法是：①用F(ab)2替代完整的IgG;②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性(63℃，10 min)IgG的固相吸附劑處理(將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效);③檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。
4）補體
ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補體C1q分子結(jié)合位點被暴露出來，使C1q 可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本;②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。
