從技術(shù)上說，IHC和ICC實驗并不難，然而，每個實驗又有那么多的變量需要鑒定和優(yōu)化。若運氣不佳，實驗結(jié)果不太好，那么我們可能要做個troubleshooting，看看問題到底出在哪兒。下表就列出了由上海遠慕資深技術(shù)解析的IHC/ICC實驗的常見問題，以及相應(yīng)的對策。
　　
　　問題1：缺乏染色
　　
　　可能原因?qū)Σ?br />　　
　　缺乏抗原通過原位雜交檢查蛋白表達。
　　
　　因儲存不當(dāng)，抗體不起作用按照說明書上的說明儲存。一般來說，將抗體分裝成小份，足夠單次實驗使用。將這些抗體儲存在手動除霜的冰箱中（-20to-70°C），避免反復(fù)凍融。
　　
　　一抗或二抗失活獨立檢測報告系統(tǒng)，以評估試劑是否有用。
　　
　　組織固定不足嘗試增加固定時間或換一種固定劑。
　　
　　組織過度固定減少浸潤或固定后步驟的持續(xù)時間。如果浸潤固定無法避免，那么通過抗原修復(fù)試劑，讓抗原不被遮蔽。
　　
　　一抗與二抗不兼容使用能與一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗來自兔子，那么就使用抗兔的二抗。
　　
　　在固定或包埋過程中表位已改變通過各種抗原修復(fù)技術(shù)嘗試恢復(fù)免疫反應(yīng)性。
　　
　　在58°C或以下包埋組織。
　　
　　抗原修復(fù)不起作用增加處理時間或改變處理溶液。
　　
　　試劑遺漏或順序不對重復(fù)染色過程，確認(rèn)使用了正確的試劑，并以正確順序添加。
　　
　　問題2：高背景
　　
　　可能原因?qū)Σ?br />　　
　　一抗或二抗的濃度高滴定抗體，以確定促進一抗和二抗的特異反應(yīng)所需的zuijia濃度。。
　　
　　組織中抗體和蛋白的疏水相互作用降低抗體稀釋液的離子強度（特別是單克隆抗體）。
　　
　　一抗或二抗與組織的非特異結(jié)合在一抗孵育之前采用封閉步驟（通常使用1%BSA和10%正常驢血清）。脫脂奶粉也是個選擇。
　　
　　二抗的非特異結(jié)合使用交叉反應(yīng)性IgG被去除的抗體。
　　
　　組織變干在染色過程中避免讓組織變干。
　　
　　離子相互作用引起的背景提高稀釋液的離子強度。
　　
　　問題3：細胞/組織形態(tài)被破壞
　　
　　可能原因?qū)Σ?br />　　
　　抗原修復(fù)方法太過劇烈根據(jù)經(jīng)驗確定實驗條件，既能保留組織形態(tài)，又能恢復(fù)抗原的免疫反應(yīng)性
　　
　　組織切片從玻片上脫落增加固定時間。根據(jù)經(jīng)驗確定另一種固定劑。
　　
　　組織切片撕裂或折疊。切片下有氣泡重新切片，或在分析結(jié)果時忽略受損區(qū)域。
　　
　　組織形態(tài)的分辨率差切出更薄的組織切片。冰晶可能會破壞冰凍切片的形態(tài)。
　　
　　固定不足在染色過程中會導(dǎo)致組織或細胞受損延長固定時間。提高固定劑/組織的比例。切出更小的組織，以便更*的浸潤。
　　
　　組織自溶導(dǎo)致壞死碎片的染色延長固定時間、比例?？紤]使用交聯(lián)的固定劑。
　　
　　問題4：染色不當(dāng)
　　
　　可能原因?qū)Σ?br />　　
　　固定方法不當(dāng)嘗試另一種固定劑，或延長固定時間。
　　
　　抗原修復(fù)可能不當(dāng)嘗試另一種抗原修復(fù)條件。
　　
　　抗原的靜電荷被改變嘗試調(diào)整抗體稀釋液的pH或陽離子濃度。
　　
　　固定拖延導(dǎo)致抗原擴散快速固定組織。嘗試交聯(lián)固定劑，而不是有機固定劑。
　　
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