剛開始做 Western blot 的同學(xué)們想必都大多都是研究生，雖然科研經(jīng)歷還不是特別豐富，但情感經(jīng)歷一定都比較豐富吧。
同學(xué)們想想自己剛談戀愛的時候，你剛喜歡一個人卻還沒表白之前，是不是每天都要想盡一切辦法了解他/她的愛好，他/她的習(xí)慣，他/她每天的路線等等，等你心里有數(shù)之后再開始考慮如何表白？
做實驗也一樣，在開始 Western 之前，盡可能多的了解你的目的蛋白，這和談戀愛一樣，這樣表白成功的概率才會大大增加。
當(dāng)然，表白失敗也很正常，我們之前做的功課只是增加成功的概率而已，并不能減少失敗的概率，所以同學(xué)們做實驗時也不要過于有心里負(fù)擔(dān)，怕這怕那的，要保持一個自然的心態(tài)，否則容易抑郁。
今天我們就來看一看生物信息學(xué)的各種神器是如何來幫助我們的 Western blot 實驗。大家在查找抗體的時候有沒有看見免疫原的序列和這兩個圖標(biāo)呢？
這個意思就是說廠家在生產(chǎn)這個抗體的時候，先是合成了一段肽鏈，這個肽鏈的氨基酸序列是從蛋白質(zhì)序列里面摘錄的，下面 blast with 意思就是分別和 NCBI 的數(shù)據(jù)庫或 Expasy 的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫里的蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行比對。
這個 blast 算法是比較復(fù)雜的，但對于我們醫(yī)學(xué)科研來說，只需要知道 blast 就是一個序列比對的算法和工具就可以了。
前段時間有同學(xué)拿 α 腎上腺素能受體這個蛋白來問我，想得到一些指導(dǎo)，那么我就從以下五個問題來幫助他分析一下這個蛋白。
一：有沒有這個蛋白的抗體？
我們以 Abcam wang站為例，簡單搜索一下，發(fā)現(xiàn)有很多相關(guān)的抗體，對于受體這樣豐都不高的蛋白質(zhì)，還是建議選擇單克隆抗體。
二：蛋白在什么組織中表達(dá)？
這個同學(xué)拿這個蛋白來問我的時候說，想研究大腦里的表達(dá)情況。如果你沒有太多時間去研究綜述的話，簡單的辦法就是看 wiki 百科了。從 wiki 的介紹里可以看到，這個受體在神經(jīng)元里是能夠表達(dá)的，所以這個問題就解決了。
三：蛋白在哪里？
這個從 wiki 百科句話我們就看到了，這是一個 G 蛋白偶聯(lián)受體，肯定是一個跨膜蛋白無疑了，這也意味著這個蛋白不是那么容易做的。
四：如果是跨膜蛋白，跨幾次？
既然是跨膜蛋白，跨了幾次膜，有幾個壓基在胞外，有幾個亞基在胞內(nèi)？這時我們可以用 SOSUI 這個wang站來查詢。
五：蛋白的序列？分子量？PI？
我們先要從 NCBI 里查找一下這個蛋白質(zhì)的氨基酸序列，我們以小鼠為例（mus musculus），如下圖所示：
然后我們把這個序列貼到 SOSUI 里面：
然后接得到這這些結(jié)果：
從這個結(jié)果我們知道這個蛋白跨膜 7 次，在胞內(nèi)有兩個較大的亞基，因此我們選擇裂解液至少也要用 RIPA 而不能用 NP40，否則不能把這個蛋白從細(xì)胞膜里面拽出來，或者需要用專門的膜蛋白提取試劑盒來操作。
選抗體的時候需要注意一下它的免疫原氨基酸序列是否是胞內(nèi)的氨基酸序列，因為這樣抗體識別的效果是jia的。
然后我們要計算一下 PI，可以用這個工具：
輸入氨基酸序列之后就得到了分子量和等電點(diǎn) PI：
這個信息對于我們選擇哪種轉(zhuǎn)膜緩沖液非常有幫助。
如果 PI 接近轉(zhuǎn)膜緩沖液的 pH 的話，蛋白質(zhì)電離程度小，帶的電荷就少，轉(zhuǎn)印效率就會非常低。
所以對這種蛋白質(zhì)，你選擇常規(guī)的 pH8.8 的轉(zhuǎn)膜緩沖液可能就不合適，至少應(yīng)該選 pH11 的 CAPS 轉(zhuǎn)膜緩沖液或者用 0.7% 乙酸的酸性轉(zhuǎn)膜液效果才會比較好。
否則不管你轉(zhuǎn)膜時間多長，蛋白質(zhì)都在凝膠里一動不動，顯然實驗室不會出結(jié)果的。如果你用酸性轉(zhuǎn)膜液的話，記得把膜放在凝膠的上面，因為此時蛋白質(zhì)是往負(fù)極移動的。
轉(zhuǎn)載于丁香園
