三代測(cè)序技術(shù)興起已經(jīng)不是一天兩天的事情,可是好多小伙伴對(duì)它的認(rèn)知好像僅僅限于一個(gè)名詞,沒(méi)有具體去深入了解過(guò),以為可能就是跟現(xiàn)在的二代測(cè)序技術(shù)沒(méi)有什么差別,只是升級(jí)版而已,小編很負(fù)責(zé)任的告訴你,在你不知道的時(shí)間里,它已經(jīng)成為科研領(lǐng)域*的一種主流技術(shù),廣泛應(yīng)用于基因組Denovo、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)、宏基因組、重測(cè)序和變異檢測(cè)等多個(gè)方向,并且在染色體結(jié)構(gòu)變異(SV)的檢測(cè)中有著不可替代的優(yōu)勢(shì)。
特別是隨著近兩年 eccDNA(extrachromosomal circular DNA)即染色體外環(huán)狀DNA成為科研界的寵兒,三代測(cè)序技術(shù)geng是被推上了浪潮的。
第三代測(cè)序技術(shù)主要有兩大技術(shù):
第1是單分子實(shí)時(shí)熒光測(cè)序,脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記,顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度;當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候,它的熒光就同時(shí)在DNA鏈上被探測(cè)到;當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候,它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除,熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性,并且在熒光被切除之后,合成的DNA鏈和天然的DNA鏈*一樣。
優(yōu)點(diǎn):
(1)可以通過(guò)檢測(cè)相鄰兩個(gè)堿基之間的測(cè)序時(shí)間,來(lái)檢測(cè)一些堿基修飾情況,即如果堿基存在修飾,則通過(guò)聚合酶時(shí)的速度會(huì)減慢,相鄰兩峰之間的距離增大,可以通過(guò)這個(gè)來(lái)直接檢測(cè)甲基化等信息
(2)測(cè)序速度很快,每秒約10 個(gè)dNTP
(3)讀長(zhǎng)長(zhǎng)(約50kb):超長(zhǎng)讀長(zhǎng)可獲得mRNA全長(zhǎng)序列及完整結(jié)構(gòu)信息,提高拼接效率,轉(zhuǎn)錄本無(wú)需拼接;克服無(wú)參考基因組物種轉(zhuǎn)錄本拼接短、信息不完整的難題;實(shí)現(xiàn)有參考基因組物種研究可變剪切及融合基因等結(jié)構(gòu)變異。精-準(zhǔn)重構(gòu)轉(zhuǎn)錄組/基因組全貌
(4)直接對(duì)原始DNA/RNA樣本測(cè)序,無(wú)需PCR擴(kuò)增,無(wú)GC偏好性
(5)需要的樣品量很少,樣品制備時(shí)間花費(fèi)少
缺點(diǎn):
(1)測(cè)序錯(cuò)誤率比較高(這幾乎是目前單分子測(cè)序技術(shù)的通?。?,達(dá)到15%
好在它的出錯(cuò)是隨機(jī)的,并不會(huì)像第二代測(cè)序技術(shù)那樣存在測(cè)序錯(cuò)誤的偏向,因而可以通過(guò)多次測(cè)序來(lái)進(jìn)行有效的糾錯(cuò)
(2)依賴(lài)DNA聚合酶的活性
(3)成本比二代測(cè)序較高
第二是納米孔測(cè)序,新型納米孔測(cè)序法(nanopore sequencing)是采用電泳技術(shù),借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過(guò)納米孔來(lái)實(shí)現(xiàn)測(cè)序的;由于納米孔的直徑非常小,僅允許單個(gè)核苷酸聚合物通過(guò),而ATCG單個(gè)堿基的帶電性質(zhì)不一樣,通過(guò)電信號(hào)的變化差異就能檢測(cè)出通過(guò)的堿基類(lèi)別,從而實(shí)現(xiàn)測(cè)序。
優(yōu)點(diǎn):
(1) 測(cè)序讀長(zhǎng):大約在幾十kb,甚至100 kb,理論上只要DNA分子不斷開(kāi)就可以一直通過(guò)納米孔(比如很火的eccDNA,往往比較大,并且往往攜帶多個(gè)染色質(zhì)來(lái)源的序列,因此僅用二代測(cè)序很難完整構(gòu)建出eccDNA的全長(zhǎng)序列。三代測(cè)序技術(shù)顯著提高了測(cè)序中分子讀長(zhǎng)的問(wèn)題,可以用于eccDNA的全長(zhǎng)序列鑒定)
(2) 可以直接讀取甲基化的胞嘧啶,不必像二代測(cè)序那樣需要對(duì)基因組進(jìn)行bisulfite處理(怎么理解:也就是用三代測(cè)序做一個(gè)全基因組測(cè)序的話,可以同時(shí)有DNA甲基化的數(shù)據(jù)分析)
(3) 測(cè)序通量很高(30x人類(lèi)基因組有望在一天內(nèi)完成);
(4) 起始DNA在測(cè)序過(guò)程中不被破壞;
(5) 以及樣品制備簡(jiǎn)單又便宜
缺點(diǎn):
(1) 測(cè)序準(zhǔn)確率:Nanopore測(cè)序準(zhǔn)確率和Pacbio持平,為86%左右。而且起始位置正確率偏低,在大約100nt位置達(dá)到穩(wěn)定,且錯(cuò)誤為隨機(jī)測(cè)序錯(cuò)誤。如果是對(duì)DNA正負(fù)鏈都進(jìn)行測(cè)序,可以達(dá)到96%的準(zhǔn)確率
(2) 切斷的核苷酸可能被讀錯(cuò)方向