【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

（1）了解細(xì)菌對(duì)大分子物質(zhì)水解的原理和方法。

（2）了解糖發(fā)酵、IMViC和H2S試驗(yàn)的原理和方法。

（3）通過(guò)不同微生物對(duì)不同物質(zhì)的利用和代謝能力，認(rèn)識(shí)微生物生理類型的多樣性。

【實(shí)驗(yàn)原理】微生物代謝類型的多樣性使得微生物在自然界的物質(zhì)循環(huán)中起著重要作用，同時(shí)為人類開(kāi)發(fā)利用微生物資源提供更多的機(jī)會(huì)與途徑。微生物代謝類型多樣性具體表現(xiàn)在生理生化反應(yīng)的多樣性。不同細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，分解糖類、氨基酸等有機(jī)物的能力各異，從而使產(chǎn)生的分解產(chǎn)物亦有不同。因此，借助各種生理生化反應(yīng)可以鑒別細(xì)菌的種類，這是微生物分類鑒定的重要依據(jù)。

1．大分子物質(zhì)水解微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中需要不斷地從外界環(huán)境中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。環(huán)境中的大分子有機(jī)物必須經(jīng)微生物分泌的胞外酶將其分解為小分子有機(jī)物才能被細(xì)胞吸收利用。不同的微生物分解利用生物大分子的能力不同，只有那些能夠產(chǎn)生并分泌胞外酶的微生物才能利用相應(yīng)的大分子有機(jī)物。微生物是否具有利用某種大分子物質(zhì)的能力，可通過(guò)觀察細(xì)菌菌落周圍的底物變化來(lái)判斷，如淀粉遇碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色，但在細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域，用碘測(cè)定不再產(chǎn)生藍(lán)色，表明細(xì)菌能水解淀粉。

2．糖發(fā)酵試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)常用于鑒定細(xì)菌對(duì)葡萄糖和乳糖等單糖的利用能力。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們?cè)诜纸馓穷愇镔|(zhì)的能力上有很大的差異。有些細(xì)菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。產(chǎn)酸情況一般用溴甲酚紫指示劑判別，產(chǎn)氣情況則通過(guò)觀察液體培養(yǎng)基中倒置的德漢氏小管是否有氣泡來(lái)判斷。

3．IMViC和H2S試驗(yàn)IMViC試驗(yàn)是吲哚試驗(yàn)（indol test）、甲基紅試驗(yàn)（methyl red test）、伏-普試驗(yàn)（Voges-Prokauer test）和檸檬酸鹽試驗(yàn)（citrate test）的縮寫，主要用于水的細(xì)菌學(xué)檢查。吲哚試驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌對(duì)色氨酸的利用能力。有些細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚和丙酮酸，吲哚本身無(wú)色，不能直接觀察到，當(dāng)加入對(duì)二甲基氨基苯j(luò)ia醛試劑時(shí)，可形成紅色的玫瑰吲哚，即吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性。甲基紅試驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖的產(chǎn)酸能力。當(dāng)細(xì)菌代謝糖大量產(chǎn)酸時(shí)，就會(huì)使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橘黃色（pH6.3）變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性。伏-普試驗(yàn)用來(lái)測(cè)定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力。如產(chǎn)氣腸桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生的丙酮酸大量進(jìn)行縮合、脫羧，生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普反應(yīng)陽(yáng)性。檸檬酸鹽試驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌利用檸檬酸的能力。有些細(xì)菌能分解檸檬酸形成CO2，同時(shí)由于培養(yǎng)基中鈉離子的存在而形成碳酸鈉，使pH升高。若用溴麝香草酚藍(lán)作為指示劑，培養(yǎng)基顏色由綠色（pH6.0～7.6）變?yōu)樗{(lán)色（pH>7.6）時(shí)，即反應(yīng)陽(yáng)性。硫化氫試驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)某些細(xì)菌能否分解含硫氨基酸，生成硫化氫。硫化氫遇培養(yǎng)基內(nèi)的鐵鹽或鉛鹽，則形成黑褐色的硫化鐵或硫化鉛沉淀物。黑褐色沉淀物愈多，表示生成的硫化氫量愈多。

【實(shí)驗(yàn)器材】

1．菌種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）。

2．培養(yǎng)基淀粉培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鈉斜面培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨培養(yǎng)基。3．試劑盧戈氏碘液、甲基紅試劑、40％KOH溶液、5％α-萘酚、乙mi、吲哚試劑。4．儀器和用具培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、接種環(huán)、接種針、無(wú)菌培養(yǎng)皿、試管、試管架、記號(hào)筆等。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1．大分子物質(zhì)水解

（1）淀粉水解

1）制平板：將淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50℃左右，倒入無(wú)菌平皿，冷凝制成平板。在平皿底部用記號(hào)筆將平板劃為二等份（視需要定，一般至多五等份）。2）接種：將枯草芽孢桿菌和大腸桿菌分別劃線接種在zhi定區(qū)域，做上記號(hào)。3）培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。4）觀察：打開(kāi)皿蓋，滴加少量碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。如果菌落周圍出現(xiàn)無(wú)色透明區(qū)，則說(shuō)明淀粉已被水解。

（2）明膠水解明膠是一種動(dòng)物蛋白，用其配制的培養(yǎng)基在低于20℃的溫度下凝固，高于24℃的溫度下自行液化。明膠在細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶（胞外酶）作用下，可水解成為小分子物質(zhì)，此時(shí)雖在低于20℃的條件下，亦不再凝固，而由原來(lái)的凝固狀態(tài)變?yōu)橐后w狀態(tài)。

1）接種：用穿刺法將枯草芽孢桿菌和大腸桿菌分別接種在2支明膠培養(yǎng)基試管中。2）培養(yǎng)：20℃下培養(yǎng)48h。3）觀察：觀察培養(yǎng)基是否液化（圖6-1）。如果細(xì)菌在此溫度下不能生長(zhǎng)，則必須在所需的蕞適溫度下培養(yǎng)。觀察結(jié)果時(shí)需將試管從恒溫箱中取出，置于冰浴或冰箱中，30min后取出立即傾斜試管，如試管中培養(yǎng)基部分或全部呈液化狀態(tài)，表明試驗(yàn)菌為陽(yáng)性；否則為陰性。

圖6-1 明膠穿刺液化的觀察

2．糖發(fā)酵試驗(yàn)

（1）葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)

1）接種：分別將大腸桿菌和普通變形桿菌接種于葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管中，另取一支相同培養(yǎng)基試管不接種作為空白對(duì)照。注意：接種前檢查培養(yǎng)基，其中倒立小管應(yīng)無(wú)氣泡。2）培養(yǎng)：37℃培養(yǎng)，分別在24h、36h、72h時(shí)觀察結(jié)果。3）觀察：若糖發(fā)酵培養(yǎng)基中所含的葡萄糖而產(chǎn)酸，則指示劑使培養(yǎng)基由紫色（pH6.8）轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（pH5.2）；如果發(fā)酵葡萄糖時(shí)產(chǎn)酸兼產(chǎn)氣，則培養(yǎng)基除變色外，倒置的德漢氏小管內(nèi)有氣泡產(chǎn)生。注意：應(yīng)先確定細(xì)菌是否生長(zhǎng)，若生長(zhǎng)，則培養(yǎng)基變混濁。生長(zhǎng)緩慢者需延長(zhǎng)培養(yǎng)觀察時(shí)間。

（2）乳糖發(fā)酵試驗(yàn)方法同上，所用培養(yǎng)基為乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。

3．IMViC試驗(yàn)和H2S試驗(yàn)

（1）吲哚試驗(yàn)

1）接種：分別將大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌接種于蛋白胨水培養(yǎng)基試管中，另取一支不接種作為對(duì)照。2）培養(yǎng)：37℃培養(yǎng)24h。3）觀察：在培養(yǎng)液中加入乙mi約1mL，充分振蕩，使吲哚溶于乙mi中。靜置片刻，待乙mi層浮于液面后形成明顯的乙mi層，再沿管壁加入吲哚試劑8～10滴。如有吲哚存在，則乙mi層呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)；不呈現(xiàn)紅色則為陰性反應(yīng)。注意：加入吲哚試劑后試管不可再搖動(dòng)，否則結(jié)果不明顯。

（2）甲基紅試驗(yàn)和伏-普試驗(yàn)1）接種：分別將大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基試管中，連同空白對(duì)照置37℃培養(yǎng)24h。2）觀察：取潔凈空試管，將每支試管中培養(yǎng)液一分為二，分別用于甲基紅試驗(yàn)和伏-普試驗(yàn)。3）甲基紅試驗(yàn)：沿試管壁向培養(yǎng)液中加入甲基紅試劑4～6滴，呈鮮紅色者為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，呈橘黃色者為陰性。4）伏-普試驗(yàn)：在培養(yǎng)液中加入40％KOH溶液10滴，再加入等量的5％萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃恒溫箱中保溫15～30min或在沸水中加熱1～2min，如培養(yǎng)液呈紅色為反應(yīng)陽(yáng)性。

（3）檸檬酸鹽試驗(yàn)1）接種：分別將大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌接種于檸檬酸鈉培養(yǎng)基斜面上，另取一支不接種作為空白對(duì)照。2）培養(yǎng)：37℃培養(yǎng)24～48h。3）觀察：觀察培養(yǎng)基顏色變化，含有溴麝香草酚藍(lán)的斜面呈藍(lán)色者為陽(yáng)性反應(yīng)，呈綠色者為陰性反應(yīng)。

（4）H2S試驗(yàn)

1）接種：穿刺接種大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌于檸檬酸鐵銨培養(yǎng)基中。2）培養(yǎng)：37℃培養(yǎng)24h。3）觀察：沿穿刺線部位呈黑褐色者為陽(yáng)性，顏色不變則為陰性。

【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】1．實(shí)驗(yàn)結(jié)果將結(jié)果填入表6-1～6-3，以“＋”表示陽(yáng)性反應(yīng)，以“—”表示陰性反應(yīng)。

表6-1 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

表6-2 大分子物質(zhì)水解試驗(yàn)結(jié)果

表6-3 IMViC和H2S試驗(yàn)結(jié)果