使用分光光度計測定蔗糖含量
點(diǎn)擊次數(shù)：712 更新時間：2022-06-02
使用分光光度計測定蔗糖含量
酶是非常有用的助手，憑借其*的專一性和重現(xiàn)性能夠檢測到所需的分子。正是因?yàn)橛写颂匦裕麄兛芍谱鞒蓹z測試劑盒，用來檢測果汁、紅酒、啤酒、雞蛋和肉類等各類食品的各種底物如糖和其它碳水化合物、酸和醇等。酶試劑盒受歡迎還因?yàn)樗腥缦聝?yōu)點(diǎn)：首先，和其它測試方法比起來它的樣品制備快速且簡單。其次，每次測試的成本非常低測試不需要任何危險試劑。酶試劑盒的原理是基于輔酶系統(tǒng)煙/酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD/NADH）的顏色變化進(jìn)行檢測 – 還原態(tài)(NADH)在340nm有光譜吸收。我們通過檢測軟飲料中的蔗糖含量來舉例說明。蔗糖被酶分解成葡萄糖和果糖。然后通過己糖激酶將葡萄糖和果糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。另外一種酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖。在后一個反應(yīng)中，輔酶NAD被還原成NADH。NADH的生成可以通過測量340nm的吸收峰檢測到，它直接與樣品中的蔗糖含量成比例。然而，由于大部分樣品不僅含有蔗糖，也含有葡萄糖，而且葡萄糖也會代謝產(chǎn)生NADH，因此在計算中必須減去葡萄糖的量。
酶是非常有用的助手，憑借其*的專一性和重現(xiàn)性能夠檢測到所需的分子。正是因?yàn)橛写颂匦裕麄兛芍谱鞒蓹z測試劑盒，用來檢測果汁、紅酒、啤酒、雞蛋和肉類等各類食品的各種底物如糖和其它碳水化合物、酸和醇等。酶試劑盒受歡迎還因?yàn)樗腥缦聝?yōu)點(diǎn)：首先，和其它測試方法比起來它的樣品制備快速且簡單。其次，每次測試的成本非常低測試不需要任何危險試劑。酶試劑盒的原理是基于輔酶系統(tǒng)煙/酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD/NADH）的顏色變化進(jìn)行檢測 – 還原態(tài)(NADH)在340nm有光譜吸收。我們通過檢測軟飲料中的蔗糖含量來舉例說明。蔗糖被酶分解成葡萄糖和果糖。然后通過己糖激酶將葡萄糖和果糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。另外一種酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖。在后一個反應(yīng)中，輔酶NAD被還原成NADH。NADH的生成可以通過測量340nm的吸收峰檢測到，它直接與樣品中的蔗糖含量成比例。然而，由于大部分樣品不僅含有蔗糖，也含有葡萄糖，而且葡萄糖也會代謝產(chǎn)生NADH，因此在計算中必須減去葡萄糖的量。
實(shí)驗(yàn)過程
進(jìn)行測試時，作為對照品的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品和相應(yīng)的空白必須根據(jù)試劑盒制造商的要求在標(biāo)準(zhǔn)1cm石英比色皿中制備，此次實(shí)驗(yàn)使用的是遠(yuǎn)慕生物試劑盒，如下表所示。
比色皿 | 蔗糖分析試劑[mL] | 樣品量[mL] | 水[mL] |
蔗糖分析試劑空白 | 0.1 | - | 0.1 |
葡萄糖分析試劑空白 | - | - | 0.2 |
對照品空白 | - | 0.1 | 0.1 |
對照品測試 | 0.1 | 0.1 | - |
樣品空白 | - | 0.1 | 0.1 |
樣品測試 | 0.1 | 0.1 | - |
將每個比色皿中物質(zhì)混合均勻并在室溫靜置10分鐘。然后將2.0 mL葡萄糖分析試劑加入到每個比色皿中，混合均勻并在室溫再靜置15分鐘。
如果儀器配備了自動多聯(lián)池，可以一次加載所有的空白、對照品和樣品，使得測量流程變得更便利。
通過下面公式計算得到蔗糖濃度。首先計算總空白，它包括了樣品和試劑的吸光度：
A(總空白)=A(樣品/對照品空白)+A(蔗糖分析試劑空白)-A(葡萄糖分析試劑空白)
對于樣品和對照品，因生成NADH產(chǎn)生的吸光度差值可如下計算：
ΔA=A樣品/對照品測試-A總空白
現(xiàn)在就可以計算得到蔗糖濃度了：
（ε：蔗糖的吸光系數(shù)，d：光程）
總結(jié)：蔗糖含量可以很容易的使用酶試劑盒和紫外可見分光光度計進(jìn)行測量。酶分析強(qiáng)大之處在于高專一性和靈敏性，可以分辨蔗糖和其它糖分子如葡萄糖和果糖。酶分析可以廣泛用于飲料和其它食品。
